Flumethrin 275: оцінка ефективності та безпечності у боротьбі проти кліщів варроа
В останні роки було покладено багато зусиль на дослідженя потенційних причин зростаючого вимирання бджолиних сімей. Проблема виявилась багатофакторною, проте зараження кліщем варроа ( Varroa destructor ) визнано домінуючим фактором у втраті сімей.
Постійний контроль варроа - трудомісткий процес, який вимагає різних заходів, як наприклад, моніторинг осипання кліща, вирізання інфікованого трутового розплоду та застосування мітицидів (протикліщових препаратів). За такого комлексного підходу до боротьби з шкідниками потрібно зважати на популяцію варроа та бджолиних сімей, щоб необхідні методи були задіяні своєчасно та у відповідний період року. З метою запобігання резистентності кліщів варроа до мітицидів варто, час від часу, змінювати характер боротьби, хоча досягти цього доволі не просто серед, переважно, непрофесійного бджолярства. Нижче, на графіку, подано приклад динаміки популяції бджолиних сімей та кліщів варроа.
Кінець літа та початок осені - критичний період у зараженні кліщем. В цей період зменшується медозбір, розмір сім'ї також скорочується через вимирання бджіл та припинення виведення нового розплоду, в результаті чого відносне засилля кліщем значно збільшується. Також, в цей період найчастіше трапляється бджолине злодійство, що може призводити до зараження кліщем варроа, який переноситься бджолами-злодійками між сім'ями чи навіть пасіками (так зване горизонтальне зараження). Як правило інфікуються сильні сім'ї, в яких найбільше запасів меду. На додачу, в цей же час, виводяться бджоли, які підуть в зиму та стануть основою для виживання і продовження сім'ї в наступному році. Через це, з метою зменшення зараження кліщем, в більшості частин Європи застосовують мітицидне лікування в кінці літа / на початку осені. Однак, визначення періоду лікування може бути досить складним, а доступні дозволені мітицидні препарати, до тепер, не покривають увесь період інфікування аж до припинення льотної активності. Таким чином, немає гарантії, що не відбудеться повторне інфікування кліщем варроа, незважаючи на проведене вдале лікування. Особливо це стосується регіонів де є багато пасік.
Смужки флуметрину 275 мг (Полівар жовтий) було розроблено як альтернативне лікування, яке покриває період в чотири місяці та може використовуватися в критичний період - від закінчення медозбору і аж до припинення льотної активності. Застосовують такі смужки на льотках. Через отвори, які є в смужці, бджола влітає та вилітає з вулика і таким чином попадає під дію активної речовини.
Дослідження, яке далі описується, проводилось з метою підтверження ефективності та безпечності комбінованої дози для застосування в бджільництві.
Матеріали та методи
Піддослідні тварини
Тридцять сімей європейської темної бджоли ( Apis mellifera mellifera ), природньо інфікованих кліщем варроа ( Varroa destructor ), були включені в дослідження. Матки віком до 2х років. На початку дослідження колонії поводились нормально, без ніяких ознак інфекційних захворювань, на 7 - 10 стільниках містився розплід різних стадій розвитку, троє стільників були повністю запечатані розплодом. Ніяке акарицидне лікування не застосовувалось мінімум 4 місяці до початку дослідження.
Утримання та догляд
Сім'ї утримувалися в одноярусних симплексних вуликах на 10 чи 11 рамок. На дні вуликів було встановлено скринінгові лотки. Пасіка знаходилась на дослідних полях Вагенінгенського науково-дослідного інституту рослинництва у Вагенінгені, Нідерланди. Інша пасіка розташовувалась на віддалі близько 400 метрів на південь. В радіусі одного кілометра не було жодних інших пасік. Великі пасіки перебували на відстані понад 4,5 км. В періоди відсутності медозбору, сім'ї підгодовувались цукровим тістом бельгійського виробництва або сиропом виробництва Німеччини. Для дослідження, вулики було пронумеровано від одного до тридцяти. Померлі матки замінювались спарованими.
Поділ на групи та лікування
В перший дослідний день сім'ї було розділено на три групи випадковим чином, в кожній групі було по 10 сімей. Група 1 отримала досліджуваний ветеринарний препарат (ДВП) в дозі двох смужок, кожна з яких містила 275 мг флуметрину. Смужки використовувались на льотках протягом першого дослідного дня (22 серпня) і 116 (16 грудня).
Група 2 лікувалась авторизованими флуметриновими смужками для використання всередині вулика (Байварол 3,6 мг смужки для вуликів, Bayer Animal Health GmbH, Німеччина) в дозі чотири смужки на сім'ю протягом першого і 42 дня, як зазначено в іструкції виробника. Байварол служив позитивним контольним препаратом (КП). Ця група використовувалась для оцінки безпечності. Оцінка ефективності (зменшення кількості кліщів) на базі КП не була доцільною через різницю в часі, яка сладала 75 дні між завершенням лікування і застосуванням після дослідного профілактичного лікування. Однак деякі додаткові аналізи було проведено з іформаційною метою.
Група 3 слугувала негативним маркером для оцінки ефективності та безпечності, і через те не отримувала ніякого лікування. Всі сім'ї одержали подальше профілактичне лікування розчином кумафосу шляхом розпилення (Перицин 32 мг/мл) згідно з інструкцією виробника на 117 день для визначення кількості залишкових кліщів.
Таблиця 1 Дослідні групи, лікування та тривалість лікування
| Група | Лікарський засіб | Період лікування | Кінцеве профілактичне лікування | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | ДВП | Флуметрин 275 мг смужки | 0 - 116 день | Перицин (кумафос), 117 день |
| 2 | КП | Байварол (флуметрин) | 0 - 42 день | Перицин (кумафос), 117 день |
| 3 | Негативний контроль | ніякого лікування | - | Перицин (кумафос), 117 день |
Підрахунок кліщів
Мертві кліщі варроа збирались на одноразові липучі дошки з сітчастою розміткою, які були вставлені в контейнери для варроа у вуликах. Липучі дошки замінювались тричі на тиждень між третім та 124 днем дослідження та не рідше ніж 2 календарні дні з моменту останньої заміни. Остання липуча дошка була замінена на 124 день та вийнята на 131. В перший та на 117 день дослідження липучі дошки були замінені до початку лікування чи після завершення експерименту. Підрахунок кліщів виконувався за межами пасіки лаборантами, які немали доступу до пасіки і таким чином не могли впливати на результати дослідження.
Огляд бджолиних сімей
Огляди проводились на третій, 14, 62 та 116 день із застосуванням методу оцінки Лібефельд. Подальше обстеження здійснювалось наступної весни на 228 день (у квітні) з початку дослідження, а останній огляд був виконаний в червні на 298 день. Оскільки виконати оцінку всіх сімей рано-вранці до початку льотної активності було не можливо, тому огляди відбувались поперемінно в кожній піддослідній групі для балансу льотної активності. Дослідження полягало в оцінюванні чисельності сім'ї (напр. площа покрита живими бджолами), площі всіяної розплодом та площі всіяної трутовим розплодом. На додачу документувались наявність та зовнішній вид яєць та незапечатаних посівів. Оцінка проводилась лише за площею всіяною розплодом, а площа незапечатаних посівів лишилась поза увагою з метою зменшення тривожності в сім'ї. Припускалось, що у такий спосіб ефект від лікування має стати помітним від збільшення як запечатаних посівів, так і розміру самої колонії. Виконувались також спроби знайти матку, а в разі провалу таких спроб, наявність розплоду сприймалась як наявність матки. Слідуючі фактори використовувались для перетворення оцінок площ в чисельність особин:
Дорослі живі бджоли: 125 бджіл на дм. кв.
Запечатаний розплід: 400 воскових чашечок на дм. кв.
Запечатаний трутовий розплід: 260 воскових чашечок на дм. кв.
Додатково, вулики оглядались ззовні для виявлення аномалій чи будь-яких ознак незвичної поведінки тричі на тиждень в період з другого і до 124 дня дослідження. Одноразово виконувався огляд на 131 день.
Підрахунок підмору
Смертність у вуликах визначалась за допомогою пасточок для мертвих бджіл. Бджоли-санітари, несучи мертвих бджіл повинні пролізти крізь металеву сітку, яка змушує санітарів губити ношу і таким чином мертві бджоли потрапляють до збирального ящика.
Збір підмору: а) пастка установлена спереду вулика, б) шухляда для збору підмору на дні пастки
Підмор виймався з пасточок тричі на тиждень між другим та 124 днем дослідження і не рідше ніж 2 календарні дні з моменту останнього виймання. Підрахунок проводився одразу ж на місці з урахування виду бджоли (лялечка, матка, трудівниця, трутень). Починаючи з 12 дня вівся облік кількості мертвих бджіл-трудівниць з ознаками інфікування вірусом деформованого крила.
Аналіз даних
Аналіз ефективності лікування в кожній сім'ї ґрунтувався на критичній оцінці зазначеній в директиві ветеринарних медичних засобів проти Varroa destructor відповідно до наступної формули:
% зменшення кількості кліщів = N кліщів знищених між першим і 117 днем х 100 / N кліщів знищених між першим і 131 днем
До аналізу входили бджолині сім'ї, які пройшли лікування ДВП (перший і 117 день) та послідуюче лікування (з 117 до 131 дня) і які показали мінімальне зараження варроа в розмірі 300 кліщів.
Результати підрахунків зменшення кількості кліщів оцінювались далі за допомогою статистичного U-критерію Манна-Уінті на основі ДВП групи та групи негативного маркеру. Як додатковий параметр ефективності, розраховувалась кількість залишкових кліщів після лікування в розподілі на 100 бджіл (рівень інфікування) за наступною формулою:
Засилля залишковими кліщами на 100 бджіл = N кліщів знищених між 117 та 131 днем х 100 / N бджіл на 116 день
Параметри безпеки аналізувались описово. Чисельність підмору досліджувалась за допомогою вище згаданого U-критерію Манна-Уінті.
Аналіз здійснювався на програмному забезпеченні Report Version 6.7 та Testimate Version 6.5
Результати дослідження
Ефективність
Нижче у таблицях підбиті підсумки за кількістю кліщів та ефективністю лікування.
Таблиця 2 Чисельність кліщів протягом різних часових проміжків дослідження
| Група | Перед дослідний період (-3 до 0 днів) | Період лікування ДВП (день 0 - 117) | Період після дослідного лікування (117 - 131 день) | Період лікування ДВП та після дослідне лікування (0 - 131 день) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 174 | (20 - 617) | 4 434 | (1 750 - 11 183) | 5 | (0 - 15) | 4 439 | (1 752 - 11 183) |
| 2 | 135 | (13 - 557) | 3 529 | (1 180 - 6 835) | 94 | (27 - 211) | 3 623 | (1 272 - 6 943) |
| 3 | 85 | (9 - 400) | 5 955 | (2 294 - 8 674) | 821 | (66 - 1 274) | 6 776 | (4 031 - 8 740) |
Таблиця 3 Результати аналізу ефективності
| Група | % ефективності | Кількість залишкових кліщів на 100 особин після 117 дня | Співвідношення сімей із залишковою інфікацією > 4% | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 99,9(99,8 - 100) | 0,1 | (0 - 0,4) | 0% | (0/8 сімей) |
| 2 | - | 2,7 | (0,6 - 6,5) | 20% | (2/10 сімей) |
| 3 | 84,9 (70,5 - 99,3) | 20,4 | (7,0 - 31,0) | 100% | (5/5 сімей) |
Станом на 131 дослідний день було встановлено, що всі сім'ї були інфіковані щонайменше 1272 кліщами, що значно перевищувало заданий поріг у 300 кліщів на сім'ю. Ефективність флуметрину 275 мг склала 99.9 %, а перевагу над групою негативного маркеру доведено статистично (р = 0,0008). Чітка різниця між двома способами лікування та негативним маркером була також разючою за кількістю залишкових кліщів у розрахунку на 100 особин (таблиця 3). Врешті-решт 95 % кліщів в групі ДВП осипались протягом перших 5 тижнів, в той час, коли в групі негативного маркеру цей показник становив лише 19 % за той самий період.
Осипання кліща за день
Безпечність
Виживання сім'ї
Загальне виживання колоній подано в таблиці 4. До застосування подальшого лікування на 117 день п'ять сімей групи негативного маркеру загинули або ж були знищені через істотне зменшення розміру сім'ї та тяжке зараження кліщем варроа. Також було знищено дві колонії з групи ДВП через скорочення чисельності сім'ї. Одна з цих сімей була найслабшою і була в процесі вимирання через тяжке зараження варроа ще на початку дослідження. Інша сім'я мала проблеми з маткою, які ймовірніше за все були ще до початку дослідження. Припускалось, що відношення до вище згаданих проблем лікування ДВП не мав. Три інші сім'ї групи негативного маркеру та одна сім'я групи КП не вижили до кінця дослідження.
Таблиця 4 Оцінка безпечності: загальне виживання, кількість мертвих чи підданих ефтаназії колоній та кількість мертвих маток
| Група | Загальне вижвання сім'ї | К-сть мертвих сімей 0 - 116 день | К-сть мертвих сімей після 116 дня | К-сть мертвих маток знадених в підморі 0 - 116 день | К-сть мертвих маток знадених в підморі після 116 дня |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 80% | 2 | 0 | 0 | 1 |
| 2 | 90% | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 3 | 30% | 5 | 2 | 0 | 0 |
Оцінка сімей
Підсумок розвитку сімей показано на графіку 6 (дорослі особини) та на графіку 7 (запечатаний розплід). Усі групи мали схожу динаміку розвитку сімей, без будь-яких відмінностей, що було розцінено як клінічно вагомий показник. Проте лише три сім'ї групи негативного маркеру дожили до моменту огляду на весні та влітку.
Графік 6. Кількість дорослих особин на сім'ю на -3, 14, 62, 116, 228 та 298 день
Графік 7. Кількість запечатаного розплоду на сім'ю на -3, 14, 62, 116, 228 та 298 день
Чисельність підмору
Чисельність підмору узагальнена на графіках 8 та 9, і показана в часовому розрізі від першого до 124 дня.
Графік 8. Кількість мертвих бджіл-трудівниць в період від 0 до 124 дня дослідження за категоріями: "нормальні" - мертві бджоли з нормальною формою крила, "деформовані" - мертві бджоли з деформованим крилом, "сумарні" - загальна кількість мертвих бджіл з деформованим і нормлаьним крилом.
Кількість мертвих бджіл, зібраних в пастки за день. Збір проводився кожні 2 - 3 дні, для наглядності кількість за день розраховувалась шляхом розділення кількості зібраних бджіл на кількість днів.
Протягом цього періоду не було виявлено жодних ознак гострої токсичності. Також, не було відмічено наростаючої токсичності в групі ДВП. Кількість зібраних мертвих бджіл-трудівниць з пасточок в групах ДВП та КП була значно нижчою порівняно з групою негативного маркеру (p не вище 0,03). Групи, які отримували ДВП чи КП мали істотно менше мертвих бджіл-трудівниць з ознаками зараження вірусом деформованого крила (p не вище 0,03). Як показано в таблиці 4, було знайдено декілька мертвих маток (одна з групи ДВП та три з КП), смерті пов'язуються з діями виконаними під час оцінювання сімей чи послідуючим лікванням, яке виконувалось в невеликому часовому розриві з досліджуваним лікуванням, окрім смерті однієї матки з групи КП. Однак, навіть і в цьому випадку, відношення смерті до лікуванням КП не дуже ймовірне, позаяк мертва матка була виявлена на 96 день, тобто 54 дні після завершення лікування КП. Кількість мертвих личинок була малою, незалежно від групи. Істотної кількості мертвих трутнів не було виявлено.
Обговорення
Дослідження показало високу ефективність флуметрину 275 мг. Велика природня смертність кліщів в групі негативного маркеру пов'язується з досить довгим періодом спостереження (4 місяці), який був потрібний для забезпечення консервативних умов оцінки безпечності.
Згідно з дослідженнями Розенкранца: один цикл реплікації кліщів варроа ставновить близько 13 днів, таким чином можна очікувати багатократну реплікацію кліщів за наявності запечатаного розплоду в групі негативного контролю переважно протягом періоду лікування. В польових умовах можна очікувати всередньому від двох до трьох репродукцій від однієї матки кліща варроа. Таким чином, протягом періоду лікування швидше за все змінилось декілька поколінь кліщів у групі негативного маркеру, в той же час ніякого істотного розмноження кліщів не відзначалось у групах до яких застосовувалось лікування. Це пов'язується з лікувальним ефектом, який спостерігався у перші п'ять тижнів дослідження.
Висока ефективність в порівнянні з групою негативного маркеру також підтверджується залишковою кількістю кліщів наприкінці лікування у розрахунку на 100 особин сім'ї. Оцінка рівня інфікування після лікування - один з додаткових важливих методів визначення ефективності та стану сімей з точки зору клінічної паразитології. Також цей показник можна використовувати для зважування доцільності зимового лікування.
Справді, зараження вище 4% розцінюється як критичне. Ступінь інфікування в групі ДВП був нижче 1% у всіх сім'ях, в той час, як засилля кліщем вище 4% спостерігалось у 20% сімей групи КП, що може вказувати на те, що, незважаючи на вдале лікування проведене пізнього літа, повторне зараження може вибухнути ще до закінчення льотної активності.
Деякі незначні відмінності в осипанні кліща на початку дослідження в гупах ДВП та КП можна пояснити різними способами механізму лікування. Застосування смужок всередині вулика може пришвидшувати взаємодію бджіл та активної речовини, аніж смужки на льотках, на дію яких впливають погодні умови, в результаті чого кількість бджіл які влітають та вилітають може то збільшуватись, то зменшуватись.
Дев'яносто п'ять відсотків кліщів, які були зібрані протягом дослідження та подальшого лікування осипались протягом перших 5 тижнів. Однак, через довгий період дослідження, результати аналізів можуть зазнавати впливу декількох чинників: таких як повторне зараження сім'ї, тож це має бути взяте до уваги. В багатовекторному дослідженні, проведеному для одного й того ж препарату, схожі розрахунки вказують, що 95% кліщів осипались щонайменше протягом перших 9 тижнів лікування.
Ефективність та важливість лікування були продемонстровані подальшим рівнем виживання: виживання сімей, в яких проводилось лікування ДВП та КП, склало 80 та 90 % відповідно, в той час, коли в групі негативного маркеру воно становило всього 30%. П'тдесят відсотків сімей групи негативного маркеру недожили до профілактичного лікування, яке послідувало на 116 день дослідження.
Високий рівень безпеки підтверджується кількістю підмору, яка була значно меншою в групах ДВП та КП, а ще менше спостерігалось мертвих бджіл з ознаками вірусу деформованого крила порівняно з групою негативного маркеру. Це ще раз висвітлило непряму важливість в потребі ефективного лікування варроа для здоров'я бджолиної сім'ї.
Декілька обставин можна віднести до релевантних в інтерпретації результатів дослідження у відношенні ефективності та безпечності. Лікування варроатозу в цьому дослідження розпочалось лише наприкінці серпня, що було відносно пізно до рекомендованого графіку проведення лікування в Нідерландах, де лікування має проводитись в липні. Щоб задовольнити умові безакарицидного лікування щонайменше 4 місяці до початку дослідження, ніяке противарроатозне лікування не могло виконуватись над сім'ями в липні, таким чином, останнє лікування, яке проводилось над піддослідними сім'ями, було взимку до початку дослідження. Виведення зимового розплоду могло співпасти із значним засиллям кліщів, що ймовірніше за все зачепило сім'ї у всіх дослідних групах.
Ймовірна шкода, заподіяна зараженням варроа вже на початку дослідження, вилилась у консервативне оцінювання безпечності. Серед сімей, які були вже ослаблені та піддались ефтаназії до проведення профілактичного лікування після дослідження була одна сім'я і з групи ДВП, яка була найслабшою ще з самого початку. Однак, через згадану смерть цієї колонії, профілактичне лікування не було проведено. Наявність контейнерів для збору підмору могла завдати певного стресу кожній сім'ї, проте сила сім'ї залишилась в межах норми.
На завершення, відмінна ефективність та безпечність флуметрину була підтвердженна в позитвному та негативному дослідженнях. Оскільки контроль за варроа передбачає використання різних засобів, тому, зважаючи на отримані результати, флуметрин 275 мг можна рекомендувати до застосування з метою боротьби та профілактики зараження Varroa destructor.
За матеріалами ECTOparasites